近来，中国科学家初次得到体细胞克隆猴的研究又一次将克隆植物继Dolly羊以来推到了飞腾，并再一次成为人们所会商的热点话题。到底甚么是植物克隆呢？
核移植90周年记
从蝾螈到克隆猴-图文详解核移植的庞大科学成长史
秦逸人 (中科院生物与化学交织研究中央)
近来，中国科学家初次得到体细胞克隆猴的研究又一次将克隆植物继Dolly羊以来推到了飞腾，并再一次成为人们所会商的热点话题。到底甚么是植物克隆呢？
“克隆”一词来自英语单词“Clone”的中文翻译，指无性孳生，为不触及生殖细胞间接由母体破裂而造成新个别的孳生体式格局，这于单细胞植物或者者低等多细胞植物中遍及存于。而更为高级的植物均为有性生殖，即由牝牡配子联合的受精卵发育而来，该生殖体式格局可以或许让基因组合的广泛变异增长子代顺应天然选择的威力。既然云云，为什么咱们要把更高级的生殖体式格局再返回到低等呢？又是经由过程甚么要领做到的呢？
由于有性生殖的发育历程很是繁杂，科学家便当用了无性生殖遗传一致性的特色想弄清晰这一历程中的一系列科学问题。而实现这一历程的要领即是核移植 (Nuclear Transfer)。核移植，顾名思义便知是将细胞核移植入另外一种细胞的历程。如许咱们就大白了称“克隆”较为通俗，而称“核移植”则更为专业。正逢核移植研究90周年，为了让各人能更深切的相识核移植研究，我特写此文先容一下核移植的庞大科学成长史。
1、人造双胞胎植物的研究为核移植提供思惟以及试验根蒂根基
有性生殖植物均为牝牡配子联合的单细胞受精卵发育而来，然而受精卵破裂后的胚胎卵裂球是否依然具有此威力呢？如下人造双胞胎植物试验研究便给了咱们科学的解答。
1. 第一例人造双胞胎植物 - 海胆
1885年，德国生物学家Hans Driesch将棘皮植物门海胆 (无脊椎植物) 的2-细胞卵裂胚胎自力分散开来，发明他们别离能发育为自力的个别[1]，这是人类汗青上第一例人造双胞胎植物，见图1。
图1：Driesch (A) 与其海胆2-cell胚胎分散试验模式图 (B, 笔者绘制)
2. 第一例人造双胞胎脊椎植物 - 蝾螈
1902年，德国胚胎学家Hans Spemann于以上海胆试验根蒂根基上，将蝾螈2-细胞胚胎用发丝结扎，分散为2个自力的卵裂胚胎，发明其也能别离发育为自力的个别[2]。这是第一例人造双胞胎脊椎植物，见图2。此外，Spemann也分散了更后期的胚胎卵裂球，发明其不克不及发育到个别。
图2：Speman (A) 与其蝾螈2-cell胚胎分散试验模式图 (B, 笔者绘制)
以上科学试验清楚地给咱们回覆了一个基本的科学问题：2-细胞胚胎期间的任何一个卵裂球均以及受精卵同样，具有发育为一个个别的威力，尔后期的卵裂球再也不具有。
2、第一例核移植植物 - 蝾螈
1928年，Spemann于其上述试验根蒂根基大将蝾螈的受精卵不彻底结扎，一半仅为胞质，另外一半含有原核，直到有核的一半发育到16-cell胚胎时将结扎线去除了，再挤压一个卵裂胚胎的细胞核进入到以前没有细胞核的胞质造成一个重构胚胎，末了将此胚胎分散出来，发明其可以发育为一个个别[2,3]，见图3。这是人类史上第一次核移植试验，它给咱们回覆了如下庞大科学问题：1. 破裂后的胚胎细胞于受精卵胞质的作用下，可以完成一个个别的发育；2. 胚胎细胞核引导胚胎的发育历程，并不是胞质。别的，Spemann也猜度: 假如哄骗发育更晚期的胚胎细胞以至一个个别的细胞核移植，可能会得到一个新个别。因以上原创性的孝敬，Spemann在1935年荣膺诺贝尔心理医学奖[4]。
图3：Spemann的核移植试验历程 (模式图由笔者所绘)
3、第一例卵细胞引诱的核移植植物 - 林蛙
1952年，英国科学家Robert Briggs 与Thomas Joseph King初次报导了以卵细胞为受体的核移植试验研究。他们的要领于Spemann的根蒂根基长进行了很年夜的革新，成长了一个至今仍使用的核移植步伐 (见图4)，即先去除了林蛙 (Rana pipiens) 卵细胞核，再将分散的林蛙胚胎细胞核打针到去核卵细胞后得到重构胚胎。他们发明这一重构胚胎可以或许继承发育为一个个别[5]，只管效率很低 (同Spemann蝾螈核移植试验效率)，尤为哄骗在发育更晚期的胚胎细胞作为供体。该试验回覆了如下主要科学问题：1. 细胞核间接引导细胞的生长以及个别的发育；2. 初期胚胎细胞能更有用的用在核移植。别的，于该文献中他们还做了一项很是有趣的试验，行将牛蛙 (Rana catesbeiana) 的胚胎细胞核移植入林蛙的去核卵，发明该重构胚胎可以或许发育到囊胚期，但随后住手发育，胚胎灭亡。这多是人类汗青上第一次异种核移植试验。
图4：1952年Robert Briggs 与Thomas Joseph King于PNAS上报导的林蛙胚胎细胞核移植研究 (A) 与该试验模式图 (B, 笔者所绘)。
4、第一例体细胞核移植植物 - 非洲爪蟾
1958年，英国科学家John Gurdon于林蛙胚胎细胞核移植试验的根蒂根基上用非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 幼体肠细胞核移植入去核卵细胞，发明该胚胎也可以发育为一个个别，而此个别的基因组与供体细胞的一致[6]，见图5。这是人类史上第一例体细胞核移植植物。它给咱们回覆了如下庞大科学问题：1. 一个分解的细胞于必然前提下可以或许逆转进而再次发育为一个别；2. 一个细胞含有所有遗传物资即即是其发生了破裂或者者分解。因以上原创性孝敬，John Gurdon荣膺2012年诺贝尔心理医学奖。
图5: John Gurdon (A) 与其于1958年于Nature上揭晓的非洲爪蟾体细胞核移植研究 (B)。
5、第一例哺乳植物核移植胚胎
因两栖类植物体外受精，卵细胞较年夜，很轻易体外试验操作。而哺乳植物体内受精，卵细胞较小 (~1000：1)，于体外操作时有很年夜的难度。1975年，英国科学家J. Derek Bromhall成长了一套哺乳植物核移植试验步伐，他哄骗煅烧拉制的细博璃管举行操作，将兔的胚胎细胞核打针入去核卵母细胞，发明此重构胚胎可以或许发育到桑葚胚，这是初次得到哺乳植物核移植胚胎的报导[7]，见图6。此研究也预示了哺乳植物核移植也有可能得到个别。
图6：1975年J. Derek Bromhall以自力作者于Nature上揭晓的兔核移植试验研究。图中左下为兔卵细胞核移植操作历程，右下为发育到桑葚期的兔克隆胚胎。
6、第一例核移植哺乳植物 - 绵羊
1986年，英国科学家Steen Willadsen将绵羊的8-cell胚胎的一个卵裂球分散出来，然后与一个去核卵母细胞举行电交融造成一个重构胚胎，他们发明这一新的胚胎不只可以或许体外继承发育，且于移植入受体子宫后，乐成地得到了3只存活的羔羊[8]，见图7。本研究为人类第一次得到核移植哺乳植物，其申明了核移植操作于哺乳植物是切实可行的，只管他们用初期胚胎细胞核作为供体，可是为哺乳植物体细胞核移植提供了试验依据。
图7：1986年Steen Willadsen以自力作者揭晓于Nature上的哄骗绵羊胚胎细胞核移植得到的克隆绵羊。
7、第一例核移���植灵长类植物 - 恒河猴
1997年，Li Meng与Don Wolf等人哄骗以上绵羊的核移植要领，初次开展了对于灵长类植物核移植的研究。他们发明胚胎卵裂球与去核卵细胞造成的重构胚胎不只能于体外举行卵裂发育，且移植入受体山公宫后乐成的得到了2只康健存活的个别[9]，见图8。这是第一例核移植灵长类植物，为体细胞克隆猴提供了试验依据。
图8：1997年Li Meng与Don Wolf等哄骗恒河猴胚胎细胞核移植乐成的得到2只克隆个别。
8、第一例体细胞核移植哺乳植物 - 绵羊Dolly
1997年Ian Wilmut与Keith Campbell等于胚胎细胞核移植绵羊的根蒂根基上，报导了哄骗成年芬多斯母羊的乳腺上皮细胞与苏格兰黑面母羊的去核卵细胞举行电交融得到重构胚胎，发明此重构胚胎可以或许体外继承发育桑葚以及囊胚期，然后将这些胚胎移植入受体羊子宫后，乐成地得到了1只存活的羔羊[10]，见图9。这是人类汗青上的首个别细胞核移植克隆哺乳植物，科学家定名它为Dolly，其社会影响力伟大，同样成为了妇孺皆知的“明星”。
图9：1997年Ian Wilmut与Keith Campbell等于Nature上报导了哄骗成年绵羊乳腺母细胞核移植得到的克隆羊Dolly。
9、体细胞克隆哺乳植物俱乐部
自克隆羊Dolly降生后，接踵于其他差别物种也证明了体细胞核移植的可行性。截止今朝，于正式国际学术期刊报导的康健存活的体细胞克隆哺乳植物有如下19种：牛 (1998年)[11]、小鼠 (1998年) [12]、山羊 (1999年)[13]、猪 (2000年)[14]、欧洲盘羊 (2001年)[15]、家兔 (2002年)[16]、家猫 (2002年)[17]、马 (2003年)[18]、年夜鼠 (2003年)[19]、骡子 (2003年)[20]、非洲野猫 (2004年)[21]、狗 (2005年)[22]、雪貂 (2006年)[23]、狼 (2007年)[24]、水牛 (2007年)[25]、红鹿 (2007年)[26]、单峰骆驼 (2009年)[27]、和近来的非人灵长类长尾猕猴 (2018年)[28]等，见图10。此中，水牛以及猕猴彻底由中国本土完成 (别离为广西年夜学以及中科院神经所)，克隆年夜鼠以及雪貂的重要完成人均为中国科学家 (论文第一作者)，这申明我国于核移植研究范畴处于国际领先职位地方。
图10：初次报导的体细胞克隆哺乳植物 (各植物照片均出自原始论文)。从左往右、从上往下依次为：Dolly、牛、小鼠、山羊、猪、欧洲盘羊、家兔、家猫、非洲野猫、年夜鼠、雪貂、狗、狼、水牛、骡子、红鹿、单峰骆驼、马及长尾猕猴。
别的，有2个新的异种克隆物种存于异样，即克隆印度野牛[29] (家牛卵细胞，2000年) 与克隆双峰骆驼[30] (单峰骆驼卵细胞，2017年)，前者于怀胎202天流产，后者于出生7天后灭亡。
10、第一例冷冻逝世尸来历的克隆植物 - 小鼠
2007年，日本科学家Teruhiko Wakayama (他初次报导得到了克隆小鼠[12]) 等报导了将彻底没有冷冻掩护剂的、于-20℃冷藏16年的小鼠尸身乐成地克隆复制[31]。于该项研究中，他们先用逝世尸各类差别构造分散的细胞核移植，发明只要年夜脑来历的细胞其克隆胚胎体外发育以及得到ESCs的效率最高。然后再哄骗年夜脑细胞来历的核移植ESCs作为供体细胞核移植 (持续核移植)，得到了4只克隆小鼠，此中2只具有一般生养功效，见图11。这项冲破性的研究给咱们解答了如下庞大问题：1. 持久冷藏的灭亡个别纵然其所有细胞也全数灭亡，只有其遗传物资不降解，就能够被克隆复制。2. 为物种整个基因组的有用贮存提供新的思绪以及要领；3. 为复生古生物提供思绪以及试验根蒂根基。
图11：2007年Teruhiko Wakayama等将彻底没有冷冻掩护的、于-20℃冷冻16年的小鼠尸身乐成地克隆。
11、第一例体细胞核移植灵长类植物 - 长尾猕猴
2018年，中科院神经科学研究所孙强与刘真等报导了哄骗食蟹猴胎儿皮肤成纤维细胞核移植，乐成的得到了2只康健的克隆个别，被定名为“中中”以及“华华”[32]，见图12。这是人类史上第一次得到的体细胞克隆灵长类植物。因非人灵长类植物被以为是人类疾病最佳的研究模子，哄骗克隆这一遗传一致性的特色便消弭了传统模子猴的个别差异，故该项研究具备庞大科学意思。
图12：2018年2月Cell以封面情势报导了中科院神经科学研究所孙强与刘真等哄骗食蟹猴胎儿皮肤成纤维细胞核移植得到的克隆猴“中中”以及“华华”。
别的值患上咱们思索的是：从胚胎细胞核移植绵羊 (1986) 到体细胞克隆羊Dolly (1997) 仅用了11年，但从胚胎细胞核移植猴 (1997) 到体细胞克隆猴却履历了21年，且哄骗成年个别体细胞 (卵丘细胞) 却没有得到乐成。这充实地申明了第一流的灵长类植物的克隆其实不像其他低等哺乳植物那样想一想的简朴，不只需要更高的技能以及难度，还需要更深切的科学切磋。故自克隆猴降生后，我将体细胞克隆植物的成长进程分为了如下三个阶段 (见图13)：第一阶段：自1958年最先报导的两栖类植物的体细胞克隆研究；第二阶段：自1997年最先报导的低等哺乳植物的体细胞克隆研究；第三阶段：自2018年最先报导的非人灵长类植物的体细胞克隆研究。
图13：体细胞克隆植物的成长进程可分三个阶段：1. 自1958年最先报导的两栖类植物克隆；2. 自1997年最先报导的低等哺乳植物克隆；3. 自2018年最先报导的非人灵长类植物克隆 (笔者所制)。
假如说体细胞克隆猴不具备庞大立异仅为换了物种的Dolly羊反复，那末Dolly又是否为胚胎细胞核移植绵羊换了一种供体细胞、是否为体细胞核移植爪蟾换了一个物种呢？针对于这些问题，咱们可以于上述核移植的成长过程中找到谜底：科学立异其实不是没有根蒂根基的突发性奔腾，而是迟缓堆集的循序式渐进；其实不是来自没有依据的蒙昧联想以及天马行空，而是来自对于现有科学常识的批判以及继续。
12、核移植于其他方面的庞大科学冲破
咱们把上述哄骗核移植得到克隆植物的研究称为生殖性克隆，如克隆六畜、克隆宠物、挽救濒危物种、得到遗传一致的植物模子等。除了此以外，哄骗核移植也能够研究其他庞大科学问题，如得到病人来历的胚胎干细胞 (Embryonic Stem Cells, ESCs)、阻断线粒体疾病的下一代遗传、提高高龄主妇卵细胞品质、得到体外造就以及遗传操作的“精子”、得到多倍体研究模子、研究基因组的不变性、研究细胞重编程机制、解答表不雅遗传学的根蒂根基问题等等。下面就这方面所做出的庞大结果举行论述。
1. 医治性克隆
医治性克隆针对于生殖性克隆而言，指体细胞克隆胚胎不移植入受体，而是于体外分散出干细胞的历程，咱们将此干细胞称为核移植ESCs。假如哄骗病人来历体细胞核移植得到干细胞，这将为量身定做，于理论上不存于免疫排斥，具备伟大的临床运用远景。于iPSCs (induced Pluripotent Stem Cells) [33]呈现以前，核移植为可以或许将体细胞改变为二倍体多能干细胞的独一要领，而iPSCs的呈现为咱们提供了另外一种路子。这时候医治性克隆的研究最先放缓，重要缘故原由为：第一，核移植研究的要求较高，不只需要更繁杂的试验装备，并且需要崇高高贵的试验技能；第二，人卵细胞的运用遭到限定。然而，于iPSCs 呈现7年后，人核移植ESCs终究得到乐成[34]，又一次将医治性克隆提到了热门。只管iPSCs具有更多的上风，照实验历程越发简捷以及普及 (如今商品化的iPS Kit能让最平凡的试验室也能弄定) 等，但核移植ESCs更靠近在天然重编程以及受精卵来历的ESCs [35]，且无基因润色，临床运用可能更为保险靠得住。故核移植ESCs与iPSCs可以举行上风互补来开展研究。下面我就归纳综合一下医治性克隆的成长过程以及所取患上的庞大冲破。
(1) 第一例体细胞核移植ESCs
2001年，Teruhiko Wakayama等于其克隆小鼠的根蒂根基上，报导了于成年小鼠体细胞克隆胚胎中分散出了具有多能性特性的核移植ESCs[36]，见图14。这也是第一例体细胞核移植ESCs，为人核移植ESCs的研究提供了试验根蒂根基。
图14：2001年Teruhiko Wakayama等于Science报导了哄骗小鼠克隆胚胎分散出的ESCs。
(2) 第一例灵长类体细胞核移植ESCs
2007年，美国Oregon国度灵长类研究中央的Shoukhrat Mitalipov等报导了于成年恒河猴皮肤成纤维细胞核移植的克隆胚胎中，乐成的分散得到了2枚ESCs，其不只有一般的核型，且具有体表里三胚层分解的多能性[37]，见图15。这是第一例灵长类体细胞核移植ESCs。
图15：2007年Shoukhrat Mitalipov等于Nature以封面文章报导了得到成年恒河猴皮肤来历的核移植ESCs。
(3) 第一例人类体细胞核移植ESCs
2013年，Shoukhrat Mitalipov等于其恒河猴核移植ESCs的根蒂根基上报导了哄骗人胎儿皮肤成纤维细胞核移植，于克隆胚胎中乐成的得到了4枚有一般二倍体核型以及具有多能性的核移植ESCs [34]，见图16。这是第一例得到的人核移植ESCs。随后，有更多的试验室也报导了得到一般成年人[38]、糖尿病[39]及老年性黄斑变性[40]病人体细胞来历的核移植ESCs，让医治性克隆再一次成为热门。
图16：2013年Shoukhrat Mitalipov等于Cell上报导了哄骗人胎儿皮肤得到人核移植ESCs的研究。于以往根蒂根基上他们革新了研究要领，重要为哄骗高品质的卵细胞以及咖啡因来提高效率。
2. 线粒体疾病的下一代预防
线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) 突变惹起的线粒体遗传病为母系遗传，经由过程卵细胞可以再通报给下一代，传统的辅助生殖要领没法做到预防，而核移植便给咱们提供了思绪，即经由过程受精卵原核交换或者患者卵细胞核 (或者极体) 移植入康健去核卵细胞即可剔除了突变的mtDNA，进而预防下一代的病发。不外哄骗此要领会使一般卵细胞捐募者的mtDNA传给患者的下一代，故此婴儿被以为存于1父2母的伦理问题。
(1) 第一例线粒体替换的灵长类植物
2009年，Shoukhrat Mitalipov等报导了将猕猴的卵细胞纺锤体掏出移植入另外一猕猴去核卵细胞的卵周隙，然后经由过程电交融的要领得到新的卵细胞。1-2小时后，于重构卵胞质中注入精子完成受精。末了将受精胚胎移植入受体子宫，乐成产下2个康健的猕猴[41]，见图17。这是首例经由过程卵细胞核移植得到的线粒体替换灵长类植物，为人类线粒体疾病研究提供了试验根蒂根基。
图17：2009年Shoukhrat Mitalipov等于Nature上报导了经由过程猕猴卵细胞核移植得到的首例线粒体替换灵长类植物。
(2) 第一例线粒体替换婴儿
2017年美国新但愿生殖中央 (私立机构) 张进等正式具体地报导了(2006年的简短报导未吐露细节) 哄骗以上猕猴线粒体替换要领，将mtDNA突变的Leigh氏综合征携带者卵细胞纺锤体移植入一般捐募者去核卵细胞组成一个新卵，再注入其丈夫的精子得到受精胚胎。对于此胚胎举行遗传筛查落伍行胚胎移植，乐成地得到一个康健男婴[42]，见图18。这是世界上首例哄骗卵细胞核移植要领得到的“三亲婴儿”，但因伦理问题张进受到美国FDA正告。
图18：2017年张进等正式报导了哄骗Leigh氏综合征携带者卵细胞纺锤体移植得到的康健婴儿。
3. 体外造就以及遗传操作的“精子”
上述所说起的研究要领均为于去核卵中注入胚胎细胞或者体细胞或者卵细胞核，假如注入一个精子会是甚么成果呢？2012年中科院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究员 (我玻士后导师) 课题组与徐国良研究员课题组互助便报导了如许的研究[43]，即于小鼠的去核卵细胞中打针一个精子，然后对于其举行激活以及造就，发明该重构胚胎不只能体外发育到囊胚阶段，且能从该胚胎中分散出ESCs，然后经由过程FACS分选，乐成地得到了单倍体细胞，称为孤雄单倍体ESCs，主要的是将此细胞注入完备卵细胞中时，发明其以及精子同样，发生受精并可发育为一个个别。别的，对于此孤雄单倍体ESCs举行体外遗传润色再受精后，也可得到遗传操作的小鼠，见图19。这是人类史上第一次将精子改变为可以或许体外持久造就以及遗传操作的具有生殖功效的单倍体干细胞，具备庞大的科学意思。该项研究也是海内生命科学范畴为数未几的原创性冲破。
图19：2012年李劲松与徐国良等于Cell上报导了哄骗核移植要领将精子改变为能于体外造就以及基因润色的且具有生殖功效的单倍体ESCs
结语
自第一例核移植植物到第一例体细胞核移植灵长类，核移植研究刚好迎来90周年，于这靠近百年的研究过程中，其不只回覆了一系列庞大科学问题，且于很多方面已经投入到了现实运用 (见图20)。然而，核移植研究另有诸多问题亟待解决：1. 体细胞核移植效率仍旧很低，重要体现于: (1) 克隆植物出生率依然于5%如下 (临床IVF婴儿出生率≥50%)，而今朝体细胞克隆猴仅来自胎儿皮肤细胞，成年体细胞却没法得到; (2) 异种克隆险些很难得到康健的个别；(3) 人核移植ESCs的效率也很低，今朝仅有几家试验室才气做到；2. 核移植的表不雅重编程机制相识甚少，今朝的年夜部门研究逗留于得到克隆个别的表象上，于机制方面深切切磋的研究却少少，这也是核移植效率患上不到年夜幅提高的底子缘故原由。假如这一问题患上不到解决，体细胞克隆猴也很难作为普及的植物模子，而复制猛犸象也仅仅是小我私家类的空想；3. 线粒体疾病的替换医治存于伦理问题，这也是拦阻其临床广泛推广的重要缘故原由。不外跟着科学的进一步成长，作为一位核移植研究事情者我信赖以上问题会取患上冲破。
图20. 核移植年夜计事年表 (以上时间均为正式期刊报导日期)。此中第一例核移植植物以及第一例体细胞核移植植物的研究别离荣膺1935年与2012年诺贝尔奖 (Nobel Prize, NP) (笔者绘制)
跋文
自2006年读玻士研究生以来便最先了对于核移植的研究，正逢核移植90周年，怀着崇拜而又冲动的表情完成为了此文，同时也为我将要写的另外一篇英文Review做一铺垫。因从原始资料的网络收拾整顿到玻文的构想撰写，再到所有图例的描绘建造，均由我一人完成，若有有余的地方，敬请各人攻讦指正！
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